Luego de unas merecidas vacaciones, retomamos la investigación.
Hoy hicimos tacos con los siguientes tejidos:
- Cerebro
- Riñon
- Intestino delgado
- Colon
En vez de procesarolos con etanol, esta vez los tacos fueron procesados con acetonas en diferentes dilusiones:
- H2O
- Acetona 25% (45 minutos)
- Acetona 40% (45 minutos)
- Acetona 70% (20 minutos)
- Acetona 85% (20 minutos)
- Acetona 100% (20 minutos)
- Xylol (10 minutos)
- Parafina
Todo lo hicimos dos veces, excepto la parafina.
Luego se cortaron en el microtomo y se realiza la inmunohistoquímica para detectar el Gb3 y la toxina SHIGA.
Arriba del corte, se le coloca agua oxigenada 0.3% en metanol, y se lo deja por 10 minutos. Eso se lava con PBS y luego se le coloca el suero de bloqueo, el cual se lo deja actuar por media hora.
Luego sacamos el suero y le colocamos el anticuerpo primario anti-Gb3, ya que en el caso de haber Gb3, este anticuerpo se le pegará. Despues se lava y se le coloca el anticuerpo secundario anti-anticuerpo Gb3 marcado con fluorescerina. A esto se lo deja por dos horas a temperatura ambiente y en oscuridad (ya que de lo contrario se consume la fluorescerina). Transcurrido ese tiempo, se lava y se coloca una mezcla de glicerol (arriba de cada corte) y PBS, dilusion de 3/2. Luego se le coloca un cubreobjeto y se lo sella con brillo transparente (se puede usar esmalte para uñas).
Una vez finalizado todo esto, se miran los portaobjetos en el microscopio con luz florescente y con filtro para floresceína.
Esto fue todo por ahora,
hasta la próxima!
Barbi y Melu.
